Síntesis y ensamblaje de controles sintéticos para detección de mutaciones puntuales por qPCR

Abstract

Para establecer ensayos moleculares, los controles positivos son un requisito indispensable para determinar la especificidad, sensibilidad y garantizar que la reacción se llevó a cabo de manera adecuada. En ocasiones es complicado contar con las secuencias biológicas que fungen como controles positivos, por lo que la alternativa es llevar a cabo la síntesis química de esas secuencias. De manera general, la síntesis química de oligonucleótidos puede generar secuencias de cadena sencilla de 200 nt, sin embargo, la producción de secuencias largas utilizadas como templados para PCR representa un riesgo de contaminación al momento de producirlos, por lo que es necesario sintetizar pequeños fragmentos que pueden ser ensamblados por PCR. Tomando como base lo anterior, se realizó el diseño, síntesis y ensamblaje de tres genes sintéticos (T4BRICKS) para la detección de las mutaciones puntuales L452R, R346K y N460K presentes en el gen S del virus SARS-CoV-2. La funcionalidad de los tres T4BRICKS fue evaluada comparando su desempeño contra los controles suministrados por el Kit comercial RT-qPCR MASTER MUT Configuración ómicron (GENES2LIFE, 2022). Los resultados obtenidos demuestran la funcionalidad de los T4BRICKS como controles sintéticos, ofreciendo una solución precisa, rápida, confiable y económica para la síntesis de secuencias complejas para su uso en técnicas moleculares como la qPCR.